8.酵 素 抗 体 法
1.4μm切片(シランコートスライド)をふ卵器で一晩、乾燥・貼り付け
2.脱パラ水洗:キシレン15分⇒下降アルコール⇒水洗
3.蒸留水洗浄 1回
4.2%過酸化水素加PBS、室温10分
5.5分の流水洗浄後、軽く蒸留水で洗浄
6.必要に応じ、抗原の賦活化(賦活化法は、免疫染色マニュアル参照)
7.PBS洗浄3回 各1分
8.組織周囲のPBSを、キムワイプでふき取る(乾燥に注意)
9.6%正常ヤギ血清を滴下し、ブロッキング 室温10分
10.キムワイプで、ヤギ血清を拭き取る(乾燥に注意)
11.一次抗体 約 100μlを滴下し、イエローチップで攪拌 室温30分
12.洗浄瓶のPBSで抗体を洗い落とす。その後、PBS洗浄3回各1分
13.組織周囲のPBSを、キムワイプでふき取る(乾燥に注意)
14.HRP-Rabbit / Mouse Envisionを2滴滴下し、イエローチップで攪拌室温30分
15.洗浄瓶のPBSで抗体を洗い落とす。その後、PBS洗浄3回各1分
16.窒化ナトリウム加DAB液に浸漬し、発色を随時観察
17.適当な時、PBSで、発色反応を停止
18.コントロール標本をチェックする。(必要に応じ、16番のDAB反応を追加する)
19.流水洗浄
20.核染色(マイヤーヘマトキシリン)30~60秒
21.水洗
22.0.3%HCIに3秒程度浸し、分別。(薄目に染めること)
23.流水水洗し、色だし 1分以上(核が、赤紫から青くなるまで)
24.脱水・封入
注意1:9番、11番の抗体を滴下する前に、組織周囲のPBSを拭き取ること。
注意2:抗体滴下後、マイクロピペットのチップで、抗体を充分に攪拌すること。